内容大纲
细胞培养与废液抽吸
细胞培养流程
废液抽吸方法的比较法
细胞培养实验室基础设备
废液处理与废弃办法
废液抽吸 (aspiration / suction) 为现代生物学技术中常用的技术,用以移除废弃液体。生物学中常见的细胞培养,是将真核或原核细胞培养于适宜的培养液 (culture medium) 及环境中,使其在受控制的状态下生长 (growth) 及增殖 (proliferation)的过程。 细胞培养的流程包含解冻细胞、培养 (cell culture)、继代培养 (俗称分盘,cell subculture) 及冷冻细胞等步骤。
然而,细胞生长过程中会产生代谢物、细胞碎片等废弃物影响细胞健康,甚至导致细胞凋亡 。因此在细胞培养过程中,需定期更换培养液,而移除旧有培养液、洗涤液的行为,则为废液抽吸。
真空废液抽吸装置 (suction system, aspiration system) 常见如上图,主要包含:
A. 真空瓶 (vacuum flask)
B. 缓冲瓶 (safety bottle)
C. 过滤器 (filter)
D. 真空源 (vacuum source)
连接并启动真空源后,细胞培养瓶/皿中的废液会因压力差而被抽吸、收集至真空瓶,缓冲瓶则做为防溢装置使用,以避免废液被抽吸至真空源内。过滤器可使用HEPA滤膜(High Efficiency Particulate Air filter 或 0.22 µm过滤器,以过滤掉废液及空气中的粒子、确保抽吸效率。
细胞培养前,请确认操作环境符合无菌操作条件,且应避免和细菌实验共享设备,以防污染。
1. 解冻细胞 (thawing cells):将冷冻细胞以 37 oC 快速解冻、回温,以避免细胞损伤。
2. 培养 (cell culture):依据细胞种类和浓度,将细胞和培养基均匀混合后,放入培养箱中培养。
3. 继代培养 (cell subculture):当细胞生长至一定程度后,收集细胞,分殖于新的培养基中。
进行继代培养时,其依细胞种类不同,处理方式可分为以下两大类:
a. 附着型细胞 (adherent cell),又称贴壁培养、单层培养 (monolayer culture)
· 去除旧培养基废液
· 以 Phosphate buffered saline (PBS) 洗涤细胞一至二次
· 加入 trypsin-EDTA溶液,于 37 oC 下作用 2~20 分钟,使细胞可自培养瓶/皿中脱落
· 加入含有血清的新鲜培养基中,以终止胰蛋白酶作用
· 将脱落的细胞及其团块打散、混合均匀后,收集所有液体
· 离心后移除上清液,并添加新鲜培养基,依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养
b. 悬浮型细胞 (suspension cell),又称悬浮培养 (suspension culture)
· 将细胞培养液以 1000 rpm 离心 5 分钟后,吸除上清液
· 加入适量新鲜培养基,与沉淀细胞混合均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养。
4. 冷冻细胞 (cryopreservation):获得目标细胞株后,将细胞悬浮于含有 5~10 % DMSO (二甲基亚砜,dimethyl sulfoxide) 及 30~50% FBS (胎牛血清,Fetal Bovine Serum) 的新鲜培养液中,以 -80 oC 或液态氮等低温设备保存。
5. 细胞计数 (cell counting):用以计算细胞浓度,可利用传统血球计数器 (Neubauer chamber) 或自动计数器 ,计算细胞浓度可用来判断目前细胞生长的情况。
废液抽吸目前有多种方法可以进行。 早期实验室多利用移液器(pipette)或电动吸管抽吸废液,然而因为需要重覆抽吸及排除液体,长时间使用下来易造成手部不适及疲劳。除此之外,电动吸管须搭配无菌刻度吸管使用,而现多使用抛弃式吸管排除污染疑虑,因此一次实验下来通常会产生大量废弃物,造成环境负担。
现代实验室则普遍会自行购置真空帮浦搭配真空瓶自行组装,如此会较电动吸管有效率,且设备取得较容易,然而自组式系统常见许多例如:管线配置不良,造成工作环境混乱、或是玻璃吸管经常破裂等安全性上的缺点。
Lafil 废液抽吸系统及 BioDolphin 废液抽吸套件主要为生命科学细胞培养或实验过程中溶液抽吸应用,可直接放置于无菌无尘操作台 (laminar flow) 使用。Lafil 废液抽吸系统整合真空源、真空瓶与废液抽吸套件,提供实验室一体化解决方案,更比传统废液抽吸系统减少一半台面占用面积,并使用围篱式平台固定真空瓶,避免操作者不小心碰触瓶身而倾倒。
洛科Lafil 废液抽吸系统及 BioDolphin 废液抽吸套件
Lafi100 无 Lafil200 有
Laifl100 :1L Lafil200:4L
PP材质或玻璃
Laif100:可 Lafil200:不可
Lafi200:可同时双人操作l
实验室电动吸管
自组真空抽吸系统
洛科废液抽吸系统
整合式设计
是,单一产品
否
是,一体化all-in-one设计
抽吸耗材
无菌刻度吸管
吸管尖 (tip
吸管尖 (tip
长时间操作
易造成手部肌肉疲劳
易造成手部肌肉疲劳
符合人体工学、单手退tip设计
吸力调节
无
有
废液清除
每次抽吸排净
吸取至真空瓶满后清除
吸取至真空瓶满后清除
真空瓶
无
通常为 1 L 抽气瓶
帮浦/设备保护
无
无
有
废液溢漏危险
无
高风险
无
置入无菌操作台
可
不可
空间利用性
体积小
管路杂乱占空间
可省去自组系统50~65%空间
环境友善
易产生大量抛弃式废弃物
易产生大量抛弃式废弃物
所有配件采用耐高温高压灭菌材质,另有节能安静的eco机种
特殊需求
无
无
无菌操作台,或生物安全柜 |
无菌操作台可作为实验室内的无菌工作区,同时也可遏止各种于微生物 实验程序中可能产生的传染性飞溅物或气胶。 |
培养箱 |
使用培养箱的目的是为细胞生长提供舒适的环境。培养箱可透过控制温度 、湿度和二氧化碳浓度提供细胞适合的生长条件。 |
废液抽吸系统 |
使用废液抽吸系统,可以更轻松地从细胞培养容器中吸除培养基和试剂。 |
光学显微镜 |
光学显微镜是细胞培养bu可或缺的工具,如正立显微镜、倒立显微镜。其将 细胞可视化,以监测细胞生长情形、细胞形态、计数与识别污染物质。 |
低温储存设备 |
随着传代次数的增加,连续培养的细胞可能会出现遗传不稳定性,如遗传漂 变、哀老; 因此将它们保存在低温储存设备中以供长期储存是细胞培养中重 要的步骤。 |
水浴器 |
细胞实验室普遍会将水浴槽设置为37 oC,用于预热培养基以及解冻冷冻细 胞或试剂等。 |
含有危险化学品(如氯)之有机废液应收集至设有适当标示之专用废液桶,不含危险化学品之其它废液可一并收集于一般混合废液桶,废油则需收集于废油桶中。细胞培养用的废液应加入适当浓度的消毒剂,如漂白水(次氯酸钠Sodium Hypochlorite),使细胞致死,再倒入水槽或废液桶。培养皿等生物医疗相关废弃物则应置于生物医疗废弃物袋中,进行高温高压灭菌后以一般废弃物丢弃,或是请依照我国生物医疗废弃物相关规定处理。
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